Diagnostiek bij Membraandefecten van de erytrocyt


 Auteur: R van Zwieten

Inleiding

Bij verdenking Hereditaire Sferocytose (HS) kunnen de volgende testen inzicht geven in een erytrocytenmembraanafwijking. Gegevens uit onderstaand onderzoek dienen in samenhang geïnterpreteerd te worden en kunnen aanwijzingen opleveren voor een ander membraandefect dan HS, zoals ovalocytose/elliptocytose en pyropoikylocytose.


Bloedbeeld en bloeduitstrijk

Bepaling van het bloedbeeld (met automaat ADVIA) en van het bloeduitstrijkje wordt op het laboratorium in Sanquin gedaan/herhaald omdat deze gegevens meestal ontbreken bij de aanvraag. B.v. bij HS is een deel van de rode cellen hyperchroom en vaak licht microcytair. Als de bevindingen passen bij de uitslagen van het overige onderzoek naar membraanafwijkingen , dan worden de morfologie uitslagen niet doorgegeven. Bijzonderheden , b.v. als het gaat om elliptocytose/ovalocytose, of als er poikilocyten worden gezien dan wordt dit wel in de uitslagbrief vermeld. 

Figuur 1: RBC indices bepaald met ‘dual angle light scatter’


Zure-glycerol lysis test (AGLT)

Hierbij wordt turbidimetrisch de lysistijd van erytrocyten in een hypotoon milieu in aanwezigheid van glycerol bepaald. Bij hereditaire sferocytose wordt een sterk verkorte lysistijd onder deze condities gevonden. Deze test heeft een gevoeligheid van ca 80 procent, maar is niet specifiek voor HS. Bij baby’s jonger dan 1 jaar kan HS worden gemaskeerd door een normale osmotische rigiditeit. Als het bloedmonster binnen 24 uur na afname wordt ontvangen kan deze test worden ingezet. 

Figuur 2: AGLT test: lysis van rode bloedcellen in waterige oplossing


Erytrocytair spectrine

Spectrine is een belangrijke component van het cytoskelet van rode bloedcellen. Bij tweederde van de HS patiënten wordt erytrocytair spectrine verlaagd gevonden. Verlaagd spectrine is specifiek voor HS. Slechts bij pyropoikilocytose, een ernstig aan elliptocytose verwant defect, is erytrocytair spectrine ook verlaagd. In sommige literatuur wordt een correlatie verondersteld tussen de hoeveelheid spectrine en de ernst van de anemische klachten. Door de gecompliceerde moleculaire oorzaken van HS is dit in lang niet alle gevallen juist. Het gehalte erytrocytair spectrine wordt bepaald dmv een radio immuno test (RIA) en wordt uitgeslagen als percentage van normaal. Minder dan 85 procent is passend bij HS.

Figuur 3


Bepaling van erytrocytair spectrine

Panel a) gelelektroforese van membraan/cytoskelet eiwitten. Laan B: anti-spectrine herkent specifiek spectrine. Laan C: alle eiwitten van het cytoskelet. Panel b) spectrinebepaling van gezonde donors (I) en spectrinebepaling van sferocytose patienten (II)

Bij baby’s jonger dan 3 maanden met een macrocytair rood bloedbeeld is erytrocytair spectrine hoog. Een eventuele deficiëntie kan hierdoor worden gemaskeerd. Bij een blijvend vermoeden van HS moet daarom de bepaling van spectrine worden herhaald als de baby ouder is en het macrocytaire beeld verdwenen.


Bepaling van band 3 expressie op erytrocyten

Met de fluorescente stof eosine 5’maleimide worden band 3, Rhesus en Rhesus-geassocieerde eiwitten op het oppervlak van rode cellen gemerkt. Bij een slechte associatie van deze eiwitten met het binnen de cel gelegen spectrinenetwerk, zoals voorkomt bij hereditaire sferocytose, wordt een verlaagde binding van deze kleurstof gevonden. Deze kleuring heeft een hoge gevoeligheid voor HS en geldt als specifiek voor dit type membraanafwijking. Ook bij pyropoikilocytose en congenitale dyserytropoiese type 2 (CDA2) worden verlaagde EMA-waarden gemeten. Ook hier geldt de verdenking dat jonge baby’s met een macrocytair rood bloedbeeld een hogere EMA-kleuring hebben. Diagnostiek dient uitgesteld, of herhaald te worden na de leeftijd van 3 maanden.


Vervormbaarheid van rode bloedcellen

Met behulp van een rheometer wordt aan rode bloedcellen in een wrijvings-stress opgelegd. Een camera registreert de vormverandering van afzonderlijke cellen. Een frequentieverdeling van de verhouding tussen de lengte en de breedte bij meer dan 1000 cellen laat zien of de gemiddelde vervormbaarheid is afgenomen en/of of dat er een populatie cellen te zien is met een veranderde vervormbaarheid. Ook wordt het oppervlak van de uitgerekte cellen bepaald. Bij HS is vrijwel altijd de vervormbaarheid verminderd door defecten in het cytoskelet, met membraanverlies als gevolg.. Deze methode helpt ons te differentiëren tussen membraanafwijkingen. Membraanafwijkingen anders dan HS vertonen vaak een andere frequentieverdeling van vervormbaarheid. Vervormbaarheid kan betrouwbaar worden gemeten binnen 24 uur na afname.


Figuur 4

 


Gelelectroforese van cytoskelet en membraaneiwitten

Wordt in de literatuur soms als gouden standaard voor membraanafwijkingen genoemd, maar is weinig gevoelig, zeker als alleen op deze methode wordt vertrouwd. Sanquin gebruikt de test vooral om kwalitatieve veranderingen in de samenstelling van deze eiwitten zichtbaar te maken, of het bijna volledig ontbreken van een eiwit. Met deze methode kan tevens onderscheid gemaakt worden tussen congenitale diserytropoietische anemie type 2 (CDAII) en HS. CDAII kenmerkt zich door een milde anemie en kan worden aangezien voor HS, echter door een veranderd molecuulgewicht van band 3 kunnen beide beelden worden onderscheiden. Ook zeldzame deficiënties van eiwitten in het cytoskelet kunnen met gelelectroforese worden opgespoord.


Figuur 5

 

Gelelectroforese van membraan en cytoskeleteiwitten van rode bloedcellen


Moleculaire diagnostiek

Dit veld is sterk in ontwikkeling, nu nog op onderzoeksbasis, maar de verwachting is dat de komende jaren de mogelijkheden voor dit type diagnostiek in Nederland zal worden uitgebreid.


Valkuilen


Benodigd materiaal en gewenste aanvullende informatie

Mocht in uw centrum geen onderzoek naar erytrocytenmembraanafwijkingen uitgevoerd kunnen worden, dan kan bovenstaand onderzoek verricht worden door Sanquin.

Voor onderzoek naar membraandefecten in rode bloedcellen is 5 ml EDTA-ontstold bloed nodig. Dit moet bij 4 OC worden verstuurd en bij voorkeur binnen 24h na afname op Sanquin worden behandeld. Daarom niet op vrijdagen insturen. Gebruik aanvraagcode B009: http://www.sanquin.nl/producten-diensten/diagnostiek/diagnostische-teste...

Indien bekend, svp op het aanvraagformulier vermelden of de anemie familiair is, en of bij de patiënt of familieleden de milt is verwijderd.



Referenties

  1. King MJ, Behrens J, Rogers C, Flynn C, Greenwood D, Chambers K: Rapid flow cytometric test for the diagnosis of membrane cytoskeleton-associated haemolytic anaemia. Br J Haematol 2000;111:924-933.
  2. van Zwieten R, Bolscher BG, Schouten-van Meeteren AY, Hoffmann JJ, Roos D: [Determination of spectrin in erythrocytes: an important aid in the diagnosis of hereditary spherocytosis]. Ned Tijdschr Geneeskd 1995;139:2256-2261.
  3. Bianchi P, Fermo E, Vercellati C, Marcello AP, Porretti L, Cortelezzi A, Barcellini W, Zanella A: Diagnostic power of laboratory tests for hereditary spherocytosis: a comparison study on 150 patients grouped according to the molecular and clinical characteristics. Haematologica 2011.
 

Laatste wijziging: 6 Nov 2012 - 15:53